述评│足细胞相关分子在临床诊治实践中的意义与思考

2  足细胞相关分子致蛋白尿发生机制的研究进展

近年来，随着分子生物学、生物信息学、基因和蛋白质组学技术的飞速发展，越来越多与蛋白尿发生密切相关的足细胞分子已经被发现，这些分子可以分为两大类，一类是通过遗传学研究已经证实其突变后可以导致蛋白尿性肾脏疾病的发生，例如：NPHS1、NPHS2、TRPC6、KANK2等［1，9，14-16］；这些分子的发现依赖于以患者临床表型为基础，对患者基因进行测序并进行致病性分析所知晓。以近期发现的KANK2为例，Gee等［16］通过对肾病综合征患者进行homozygosity mapping分析和全基因组外显子测序发现，在多个肾病综合征患者中有KANK2基因隐性突变并疑为致病突变，进一步在果蝇和斑马鱼中将KANK2进行特异性敲低发现，其可以导致足细胞功能的异常和蛋白尿的发生，最终确定其为致病基因。目前，二代测序和全基因外显子组测序的技术已经比较成熟，相信会有更多足细胞分子可以通过这一思路被发现。另一类分子是在非遗传性肾脏疾病或者模式动物学中，发现其功能异常会导致足细胞功能和结构异常，进一步导致蛋白尿发生和疾病进展，例如：SYNPO、CFL1、 Angpt14、 Tln1等［17-20］。以近期发现的Tln1为例，足细胞和基底膜之间的相互作用在维持肾小球滤过屏障完整性中非常重要，在这一过程中足细胞的黏附功能发挥着重要的作用，Tln1作为重要的黏附分子连接整合素和足细胞骨架。Tian等［20］在小鼠足细胞中特异性敲低Tln1后发现，小鼠足细胞黏附功能丧失， 足细胞中细胞骨架紊乱， 模型小鼠蛋白尿发生， 存活率下降， 导致疾病进展发生死亡， 研究者同时在肾病综合征的患者中证实Tln1基因所编码的蛋白Talin1也出现异常，最终确定了Tln1为足细胞中维持肾小球滤过屏障稳定的重要分子。

3  足细胞相关分子在临床应用中的局限性

这两类分子的发现在很大程度上加深了我们对于足细胞功能和蛋白尿性肾脏疾病发生分子机制的认识，但是在蛋白尿性肾脏疾病的监测和治疗中，这些分子的作用却是有限的。对于第一类分子，我们可以综合基因检测、临床症状、家族史发现，但是发现之后，却很难有针对性的干预措施。NPHS1及其编码蛋白nephrin作为最早发现的可以导致蛋白尿性肾脏疾病的足细胞特异性分子，至今发现已经近20年。但是在实际应用中，nephrin目前大多应用于基础研究中检测足细胞损伤的标记物，在实际临床实验室检查中鲜有涉及。这一类分子的发现对于诊断疾病有非常重要的作用，但是在疾病监测和治疗方面其作用却是有限的［1，21］。对于第二类分子，其发现主要依赖于临床病理学和一些肾脏疾病的动物模型，大多数研究报道往往涉及该类分子在肾穿标本中的检测和肾脏疾病动物模型中的蛋白和基因水平的检测，但是在实际应用中，不是所有的患者都会进行肾脏组织穿刺性检查，我们也很难获得足够的样本进行蛋白质和基因水平的检查，同时在常规的实验室检查手段（包括血液学和尿液学检查）中我们很难发现这些分子的异常。我们虽然认识了足细胞异常导致蛋白尿发生的一些分子机制，但是我们却很难特异性地针对这些分子给出相应的干预治疗。

4  如何在疾病监测中应用足细胞相关分子的思考

要将足细胞相关分子转化为临床所用，首先解决的问题就是如何在临床中简易、方便地检测到这些分子。在实际临床操作中，肾组织标本可以获得，但是对患者创伤性较大，相比而言，最容易获得的就是血液和尿液样本，因此，寻找血液和尿液中可以反应疾病进展的足细胞相关分子就是研究的重点。Jochen Reiser团队最早发现，可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体（suPAR）在原发性局灶阶段性肾小球硬化症（FSGS）患者血液中升高，并且与疾病病情程度相关，suPAR可以激活足细胞β3整合素进一步导致足细胞足突融合、蛋白尿的发生。在之后的研究中，该团队在慢性肾脏疾病的患者中也发现suPAR升高是一个肾脏疾病进展的独立危险因素，其升高可以加重估算肾小球滤过率的下降［22-23］。这些研究提示我们，suPAR可以在血液中检测到并与肾脏疾病病情相关，因此，在未来监测病情时，这一标记物可以被应用到临床中来。在血液中检测足细胞相关分子的其他研究中，有学者针对Angpt14做了一系列相关的报道，该研究团队起初在肾脏疾病模型和微小病变型肾脏的患者中发现，Angpt14在肾脏组织中表达升高，之后通过模式动物学研究证实，Angpt14在足细胞功能和蛋白尿的发生起到重要的作用。Angpt14是一种分泌型蛋白，在血液循环中可以被检测到，基于此，该研究小组在微小病变型肾病（MCD）、FSGS、膜性肾病（MN）等肾病综合征患者的血浆中检测到Angpt14上调，并与病情程度相关［18，24］。以上两种分子都是先被发现与足细胞功能相关，并且可以在血液中检测到，随后在临床中加以证实并得以应用，这一思路也可以被用来发现更为有效的足细胞相关分子。

除了血液样本外，尿液样本也可以作为突破口。尿液由肾脏所产生，决定了尿液检测可以反映肾脏功能的独特优势，但是尿液作为代谢产物，其成分复杂，容易受多种因素的影响，所以这也加大了足细胞相关分子检测的难度。尽管如此，在尿液足细胞相关分子检测方面，国内外已经有相关的研究报道［25-26］，其中Roger Wiggins团队建立了尿液足细胞计数的相关方法并且取得了一系列的进展［25，27-29］。该研究团队最早发现在蛋白尿性肾脏疾病患者的肾穿标本中，足细胞丢失与肾脏疾病的进展高度相关，足细胞丢失可以导致肾脏功能受损、蛋白尿发生、疾病进展并最终发展至终末期肾脏疾病，但是肾穿活组织检测作为有创性的检查并不完全适用于所有的肾脏疾病患者，因此，该研究小组开始从尿液中检测足细胞相关分子以确定足细胞丢失程度，最早确定足细胞特异性分子nephrin、podocin以及疾病相关分子TGF-β、AQ-2，通过一系列试验证实足细胞特异性分子podocin可以作为监测病情进展最合适的分子，通过对多种蛋白尿性肾脏疾病患者（包括MCD、FSGS、MN、Alport综合征等）的尿液样本进行检测，发现尿液podocin在肾功能异常和终末期肾脏疾病的患者中显著升高，这一研究发现极大地丰富了尿液足细胞相关分子在监测病情中的作用， 这一方法不仅可以监测疾病的进展， 同时也可以给治疗疾病提供可靠的依据［25，29］。血液和尿液检测创伤性小或无创伤、操作简单、样本容易获取， 寻找足细胞相关分子并且确定其作为监测疾病病情的标记物将是未来研究的重点。

5  如何在疾病治疗中应用足细胞相关分子的思考

所有研究的最终目的都是为治疗疾病所用，不管是足细胞在蛋白尿性肾脏疾病中发病机制的研究，还是寻找监测病情指示标记物的研究，都是为了更好地治疗肾脏疾病，因此，不管是开发新药物还是规范合理的应用老药物都是研究该类疾病的重点。microRNA作为一种非编码RNA，已经在肾脏及其他系统的研究中得到证实，其在生理和疾病状态下发挥着重要的作用［30-31］。Gomez等［32］在动物模型中证实，抗microRNA-21寡核苷酸可以通过代谢通路阻止Alport综合征小鼠肾脏疾病的进展，该研究发现，microRNA-21在Alport综合征小鼠的肾脏中表达上调，通过抗microRNA-21寡核苷酸对这些疾病小鼠进行治疗后，蛋白尿下降，肾功能恢复，存活率也得到了显著的提升，这一研究无疑为治疗Alport综合征带来了新的曙光，未来临床应用中，抗microRNA-21寡核苷酸很有可能作为一种新药治疗Alport综合征，但是从新药的研发到最终上市应用仍然是很漫长的过程。基于对蛋白尿性肾脏疾病分子机制的认识，开发新的药物进行有效干预无疑是未来治疗疾病新的方向，但是对于目前来讲，合理和规范使用老药物治疗疾病更为实际。因此，这也为老药物的作用机制认识提出更高的要求。Abatacept属T细胞抑制剂的一种，可以特异性地抑制B7-1，以往被推荐用于传统慢作用药物治疗无效的类风湿关节炎，可有效地改善症状和体征，并可缓解影像学所见关节损伤。但是在最近的研究中，Peter Mundel团队发现Abatacept作为B7-1的抑制剂可以治疗在足细胞中B7-1免疫染色阳性的患者，该研究通过体内外实验证实了B7-1在足细胞及蛋白尿性肾脏疾病中的重要作用，基于分子机制的认识，选取了5例FSGS患者，通过其抑制剂Abatacept进行治疗最终发现Abatacept对于这类患者有效［33］。除了这一免疫抑制药物外，环孢素A作为免疫抑制剂最初应用于器官移植后的患者，1974年，Shalhoub［34］提出原发性肾病综合征的发病机制和细胞免疫紊乱相关，主要是由于T细胞功能异常引起循环因子释放从而导致蛋白尿发生。基于该免疫机制，环孢素A开始用于治疗肾病综合征。但是近些年研究证实，足细胞在蛋白尿性肾脏疾病中也起到非常重要的作用而且独立于免疫机制，而环孢素A在治疗这些非免疫机制肾脏疾病时仍然有效。因此，环孢素A这一老药肯定有独立于免疫抑制外的分子机制。2008年，Faul等［35］最先发现环孢素A可以直接作用足细胞细胞骨架，分子synaptopodin，进而稳定细胞骨架阻止蛋白尿的发生。之后Li等［19，36］相继研究发现，除synaptopodin外，环孢素A还可以作用于足细胞细胞骨架分子cofilin1和WAVE1，进而维持足细胞正常功能，防止蛋白尿的发生。这些研究不仅仅丰富了环孢素A这一老药物的作用机制，同时也为今后治疗蛋白尿性肾脏疾病提供了新的线索， 环孢素A直接作用靶点是钙调神经磷酸酶calcineurin，既然环孢素A可以直接作用于足细胞及肾脏本身， 那么未来治疗蛋白尿性肾脏疾病时，我们是否应该考虑足细胞及肾脏中calcineurin的表达和活性？是否应该通过综合足细胞及肾脏本身calcineurin的变化及免疫T细胞中calcineurin的变化更为合理有效地使用该类药物？Ding等［21］近期研究发现，calcineurin在足细胞损伤中，活性增加，但是其全长分子表达下调，该结果提示，calcineurin可能存在其他活性片段，最终研究证实，calcineurin可以被calpain剪切为45 KDa的片段，并在足细胞损伤中发挥重要作用，为合理用药时考虑足细胞中calcineurin变化提供一定的理论基础。

近年的研究极大地加深了临床对足细胞在蛋白尿性肾脏疾病中分子机制的认识，在这些坚实的基础之上，临床更应该寻找有效监测和治疗蛋白尿性肾脏疾病的靶点，以期达到将科学研究成果真正转化并且为临床服务的目的。

参考文献 (略)

　　　　　　　　（2016-07-03收稿）