3月22日，《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》杂志在线发表了军事医学科学院疾病预防控制所宋宏彬（Song Hongbin）课题组题为“Removal of Integrated Hepatitis B Virus DNA Using CRISPR-Cas9”的文章，该工作在利用CRISPR-Cas9系统降解HBV cccDNA的同时，还首次实现了对HBV稳转细胞模型中全长整合HBV DNA的切除，使得细胞上清中乙肝病毒标志物的含量降至阴性临界值以下并持续10个月无复发。
[今日头条]我国科学家利用CRISPR-Cas9技术清除整合HBV DNA
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据估计，全球每年有超过68.8万人死于慢性乙肝的并发症，包括肝癌和肝硬化。目前公认的化学治疗方法包括干扰素（Interferon，IFN）和核苷类似物（Nucleoside analogue，NAs）。口服核苷类似物可以有效降低病人体内HBV DNA的水平，但存在停药后病毒暴发的危险，并且长期服用又会导致病毒抗药性的产生。干扰素虽能通过抑制病毒DNA复制和激活机体抗病毒免疫来达到治疗效果。但是在接受干扰素治疗的病人中只有不足10%产生持续的治疗作用。HBV共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）在慢性乙肝患者中稳定存在，可以作为病毒复制与表达的模板。同时，HBV DNA整合到宿主基因组中也可导致宿主基因组产生变异，比如细胞增殖、分化以等过程中所涉及的重要基因发生变异；有研究还表明HBV DNA整合是肝癌发生的重要因素。一般认为，彻底清除宿主细胞内乙肝病毒的复制根源（整合状态的HBV DNA和共价闭合环状HBV cccDNA）是治愈乙肝的标准。
最近基于细菌CRISPR系统开发出的低成本、易操作、高效快捷的CRISPR-Cas9基因编辑技术迅速地成为基因治疗最理想的工具，目前已被广泛应用于医药、生物等多个领域的研究。利用CRISPR-Cas9系统，近些年研究人员在HBV、HIV、HCV等病毒感染性疾病的研究中也取得了多项突破，SuRuLin等分别在Huh-7细胞内和高压水动力HBV小鼠模型内利用CRSIPR-Cas9系统对带有HBV基因组的重组质粒进行了破坏，并在一定程度上抑制了HBV质粒的表达。Christoph Seeger等利用CRISPR-Cas9技术敲除了HepG2细胞中的HBV受体基因NTCP，并证明CRISPR-Cas9系统可以破坏cccDNA并抑制HBV感染。S. Zhen等在HBV稳定转染模型HepG2.2.15中利用CRISPR-Cas9降低了乙肝表面抗原和cccDNA的含量。
宋宏彬课题组针对解放军第302医院构建的HBV稳定传染细胞系HepG2.A64，建立了一种特异性扩增全长整合HBV的方法，并利用靶向乙肝病毒基因组C区的gRNA/Cas9系统切除了全长整合的HBV基因组。不同于对细胞基因组的编辑，HBV稳定转染细胞模型中存在多种形式的HBV DNA（整合状态HBV DNA及作为复制中间体的环状HBV DNA），同时HBV的整合情况以及宿主细胞基因组的突变情况较为复杂，因此该研究还借助了北京百迈客公司的全基因组测序平台对清除HBV感染前后的细胞基因组突变及CRISPR-Cas9的脱靶效应进行了评估。结果并未发现明显的脱靶效应，另外在HBV清除后细胞基因组的突变也发生了减少。
延伸阅读
Li Hao, Sheng Chunyu, Wang Shan, et al. Removal of Integrated Hepatitis B Virus DNA Using CRISPR-Cas9. Front. Cell. Infect. Microbiol. 7:91.doi: 10.3389/fcimb.2017.00091
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