不同抗体检测对风湿病性葡萄膜炎的诊断价值

作者：许晓风 张举 崔莉 王艳红 岳燕 迟林 白婕 李昊淼 鲁辛辛

选自：中华医学杂志, 2017,97(04): 285-290

葡萄膜炎是一类眼部炎症性致盲性疾病，其病因复杂、种类繁多，不同地区葡萄膜炎的病因类型特征各具特色，因此早期明确病因，早期进行诊断和治疗是防治并发症、确保患者取得良好视功能的关键，了解本地区病因类型特征是临床诊治的关键^[1,2,3]。临床研究发现风湿病伴发的葡萄膜炎是葡萄膜炎三大常见类型之一^[3]，国内外学者研究发现葡萄膜炎是强直性脊柱炎(AS)常见的关节外表现^[4,5]。流式细胞术是目前广泛应用的细胞定量分析技术，人类白细胞抗原B27/B7(HLA－B27/B7)双标记单抗测定能同时测定细胞表面B27、B7表达情况，能有效排除B27和B7的交叉反应，从而减少假阳性和假阴性的发生^[6]。间接免疫荧光法具有操作简单、结果易于判断等优点，适合临床实验室常规检测^[7]。为了分析临床实验室HLA－B27、抗核抗体(ANA)、抗双链DNA抗体(anti－dsDNA)和抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)检测对风湿病性葡萄膜炎的诊断价值，了解北京及其周边地区风湿病性葡萄膜炎的病因类型特征，本研究采用流式细胞术检测非感染性葡萄膜炎患者外周血淋巴细胞HLA－B27抗原表达情况，采用间接免疫荧光法检测上述患者血清ANA、anti－dsDNA和ANCA表达情况，评估HLA－B27抗原、ANA、anti－dsDNA和ANCA检测对风湿病性葡萄膜炎的诊断价值。

对象与方法

1．研究对象：

连续收集2012年3月至2016年3月在北京同仁医院眼科就诊的、且长期在北京及其周边地区居住的初发急性葡萄膜炎患者。这些患者临床上表现为急性发作，有不同程度的视力下降、眼红、眼痛、畏光和流泪等，可见不同程度睫状充血，角膜后沉着物，前房闪辉，瞳孔缩小或虹膜后黏连以及晶状体表面色素沉着等，专科检查包括眼B超、光学相干断层成像(OCT)和荧光素眼底血管造影术(FFA)等。

共计724例患者最终被确诊为初发非感染性葡萄膜炎，并依据1979年国际葡萄膜炎研究组(IUSG)制定的分类标准，将葡萄膜炎分为前葡萄膜炎、中间葡萄膜炎、后葡萄膜炎和全葡萄膜炎^[8,9]。随后，724例患者转入风湿免疫科，由风湿免疫科医生通过详细记录相关病史、临床症状和体征，结合实验室检查、影像学和病理学等辅助检查，依据风湿病诊断标准，对患者进行风湿病及相关类型的诊断，其中有285例患者符合风湿病的诊断标准，确诊为风湿病性葡萄膜炎，进一步划分为脊柱关节炎、原发性系统性血管炎、系统性红斑狼疮、原发性干燥综合征、类风湿性关节炎和幼年性特发性关节炎性葡萄膜炎。

2．HLA－B27检测试剂与仪器：

美国Beckman－Coulter公司配套试剂，HLA－B27－FITC/HLA－B7－PE(批号A07739)，阴性对照为IgG2a－FITC/IgG1－PE(批号IM1255U)，溶血剂为OptiLyse C(批号A11895)；采用美国Beckman－Coulter公司的FC500流式细胞仪进行检测。取上述患者静脉血2 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。

3．ANA、anti－dsDNA和ANCA检测试剂与仪器：

德国欧蒙公司ANA、anti－dsDNA、ANCA间接免疫荧光法(IIF)试剂盒，德国Zeiss公司AXIOSKOP40荧光显微镜。抽取上述患者静脉血5 ml，1 610×g离心5 min分离血清，置－80 ℃冻存待检。

4．流式标本的标记方法：

按照试剂盒的要求操作，于测定管底部加入EDTA抗凝全血标本100 μl，再加入20 μl双标记HLA－B27－FITC/HLA－B7－PE荧光抗体，混匀后室温避光孵育20 min，加入溶血剂500 μl，混匀室温避光10 min，室温300×g离心5 min，弃上清后加入1 ml磷酸盐缓冲溶液(PBS)离心漂洗1次，弃上清加入1 ml PBS液混匀后上机检测，并于2 h内检测完毕。每份标本测定5 000个细胞，阴性对照管除抗体改为双标记的小鼠IgG2a－FITC/IgG1－PE外，其余步骤同上。

5．ANA、anti－dsDNA和ANCA检测标记方法：

以人喉癌上皮细胞(Hep－2)和猴肝抗原的生物载片检测患者血清ANA，血清稀释比例为1∶100、1∶320、1∶1 000、1∶3 200，以绿蝇短膜虫为基质片的生物载片检测患者血清anti－dsDNA，血清稀释比例为1∶10、1∶100、1∶1 000,以乙醇固定的中性粒细胞和甲醇固定的中性粒细胞为基质片的生物载片检测患者血清ANCA，血清稀释比例为1∶10、1∶100、1∶1 000,稀释后血清与抗原生物载片反应30 min(同时设阳性和阴性对照)，流水冲洗5 s后浸泡5 min，加入荧光标记的二抗室温避光孵育30 min，流水冲洗5 s后浸泡5 min，加甘油封片后荧光显微镜下判读结果。

6．流式分析与结果判断：

检测分析前用Flow－Check检测流式细胞仪的光路、流路、电压及增益，确定其CV值<2%。用双标记的小鼠IgG2a－FITC/IgG1－PE同型对照设立阴阳性分界线。用HLA－B27自动软件获取和分析数据。计算HLA－B27阳性/HLA－B7阴性细胞所占淋巴细胞百分比，当此百分比>80%且HLA－B27FL1信号的平均荧光强度>8.0(界值由Beckman－Coulter公司提供)，报告为HLA－B27阳性，否则为阴性。

7．ANA、抗dsDNA抗体和ANCA表达结果判断：

ANA以抗体滴度≥1∶320时判断为阳性。核型分为：胞核斑点型、胞核核仁型、胞核均质型、胞核着丝点型、胞核混合型和胞浆颗粒型等。anti－dsDNA以抗体滴度≥1∶10时判断为阳性。ANCA以抗体滴度≥1∶10时判断为阳性。ANCA有胞浆型(C－ANCA)和核周型(P－ANCA)两种荧光模型。

8．统计学分析：

应用SPSS 21.0软件，采用χ²检验进行计数资料的比较，理论频数<5时，采用Fisher精确概率法进行组间阳性率的比较；正态分布计量资料用±s表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．病例的基本特征分析：

724例初发非感染性葡萄膜炎患者年龄4～79岁，平均年龄为41岁，基本特征见表1。依据风湿病诊断标准，约39.4%的初发非感染性葡萄膜炎患者被确诊风湿病性葡萄膜炎，其中男性患者占47%。风湿病性葡萄膜炎患者中，以脊柱关节炎(176例)和原发性系统性血管炎(48例)常见；48例原发性系统性血管炎病例中包括白塞病34例、结节性多动脉炎5例、显微镜下多血管炎4例、韦格纳肉芽肿3例和嗜酸细胞性肉芽肿性多血管炎2例。

表1 724例初发非感染性葡萄膜炎患者的基本特征

2．HLA－B27抗原、ANA、anti－dsDNA和ANCA表达情况：

724例非感染性葡萄膜炎患者HLA－B27抗原、ANA、anti－dsDNA和ANCA表达情况见表2。HLA－B27阳性率约为23.2%，男性高于女性；ANA阳性率约为7.2%，女性(11.9%)高于男性(2.0%)；anti－dsDNA阳性率约为2.1%，均在女性风湿病患者中；ANCA阳性约为4.1%，女性高于男性。控制了性别因素影响后，HLA－B27抗原、ANA和ANCA在风湿病性葡萄膜炎患者中阳性率(5.3%～57.2%)高于非风湿病性葡萄膜炎患者(0～1.6%)，而anti－dsDNA仅在风湿病性葡萄膜炎患者中有表达。本研究中52例ANA的核型为胞核混合型22例，胞核均质型10例，胞核斑点型8例，胞核核仁型5例，胞核着丝点型5例，胞质颗粒型2例。ANCA阳性30例，其中C－ANCA阳性11例，P－ANCA阳性19例。

表2 不同人群中各种抗原与抗体的阳性率检测结果

3．不同类型风湿病性葡萄膜炎检测结果：

见表3。285例风湿病性葡萄膜炎发病部位主要集中在前葡萄膜和全葡萄膜，分别占49.5%(141/285)和46.3%(132/285)；HLA－B27主要在脊柱关节炎表达(阳性率约为92.1%)；ANA在系统性红斑狼疮患者中阳性率高达95.5%，原发性干燥综合征患者中阳性率约为61.1%；anti－dsDNA在系统性红斑狼疮患者中阳性率约为59.1%，在类风湿性关节炎中约为12.5%；而ANCA在风湿病性葡萄膜炎患者(除外脊柱关节炎)中均有表达，阳性率约为16.7%～45.5%。14例原发性系统性血管炎性葡萄膜炎(除外34例白塞病)患者中有8例ANCA阳性，阳性率为57.1%(8/14)。

表3 不同类型风湿病性葡萄膜炎特征分析

讨论

本研究结果显示，风湿病性葡萄膜炎患者的发病和性别没有显著关系，但不同类型风湿病性葡萄膜炎其发病有性别倾向，如脊柱关节炎性葡萄膜炎好发于男性，而系统性红斑狼疮性葡萄膜炎多好发于女性。从年龄来看，风湿病性葡萄膜炎好发于青壮年，女性的发病年龄大于男性。本研究诊断幼年性特发性关节炎5例，说明未成年患者可由幼年性特发性关节炎等风湿病引起葡萄膜炎，Foeldvari^[10]研究表明幼年性特发性关节炎是常见的儿童风湿病类型，同时幼年性特发性关节炎性葡萄膜炎容易发生严重的视力损害甚至致盲；临床医生在遇到儿童葡萄膜炎患者时应注意判断儿童葡萄膜炎患者是否患有幼年性特发性关节炎等风湿病，从而减少误诊率。脊柱关节炎和原发性系统性血管炎占据风湿病性葡萄膜炎病因的前两位，说明北京及其周边地区风湿病性葡萄膜炎的主要病因类型为脊柱关节炎和原发性系统性血管炎。在土耳其，白塞病占非感染性葡萄膜炎患者的首位^[11]，在中国台湾地区，HLA－B27相关的葡萄膜炎在非感染性葡萄膜炎患者中最常见^[12]，Generalli等^[13]报道类风湿性关节炎、干燥综合征、脊柱关节炎和ANCA相关性血管炎等风湿病可并发葡萄膜炎，本研究结果与上述结论相似，因此在临床工作中眼科医生和风湿科医生的合作非常重要，对于青壮年男性患者应考虑其发病是否与脊柱关节炎和原发性系统性血管炎有关，实验室检查应主要选择HLA－B27和ANCA；而女性患者应考虑其发病是否与系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等风湿病有关，实验室检查应主要选择ANA、anti－dsDNA和ANCA。

724例患者HLA－B27阳性率为23.2%，男性阳性率(28.3%)明显高于女性阳性率(18.5%)，和Loh等^[14]报道的阳性率大致相符，符合邹文军等^[15]报道的HLA－B27阳性葡萄膜炎好发于男性，是非感染性葡萄膜炎的常见类型。285例风湿病性葡萄膜炎患者HLA－B27阳性率(57.2%)明显高于439例非风湿病性葡萄膜炎患者(1.1%)，且在确诊的176例脊柱关节炎性葡萄膜炎患者中，HLA－B27的阳性率为92.1%，说明HLA－B27检测对脊柱关节炎性葡萄膜炎有较好的诊断价值，有助于脊柱关节炎性葡萄膜炎患者的初筛。在我国北方人群中，HLA－B27的B2704亚型比B2705亚型更易患葡萄膜炎^[16]，提示我们也要关注HLA－B27的亚型检测，从而为临床提供更有价值的诊断依据。

血清ANA检测是临床上重要的筛查实验，阳性结果常见于各种自身免疫病^[17]，及时准确检测ANA可早期正确诊断疾病，降低致残率，提高患者生活质量^[18]。724例患者ANA阳性率为7.2%，285例风湿病性葡萄膜炎患者ANA阳性率(15.8%)明显高于439例非风湿病性葡萄膜炎患者(1.6%)，说明对初发非感染性葡萄膜炎患者进行ANA检测对风湿病性葡萄膜炎诊断有初筛作用。系统性红斑狼疮性葡萄膜炎患者ANA阳性率为95.5%,原发性干燥综合征性葡萄膜炎患者ANA阳性率为61.1%，因此临床医生应结合患者临床表现，对疑似患者积极进行ANA检测，从而提高葡萄膜炎病因诊断率。

ANCA是一组以中性粒细胞胞质颗粒和单核细胞溶酶体成分为特异抗原的自身抗体^[19]，与小血管炎的发病机制有关，现在称为ANCA相关性血管炎(AAV)^[20]。研究表明特异性ANCA能给临床提供利于诊断的信息^[21]。285例风湿病性葡萄膜炎患者ANCA的阳性率(9.1%)明显高于439例非风湿病性葡萄膜炎患者的阳性率(0.9%)，同时ANCA高阳性率主要表现在原发性系统性血管炎(除外白塞病)、系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎性葡萄膜炎患者，说明ANCA检测有助于这些患者的辅助诊断。虽然白塞病在ANCA检测时常为阴性，但ANCA检测有助于其与其他疾病的鉴别诊断。

本研究中anti－dsDNA阳性只表现在风湿病性葡萄膜炎患者，阳性率为5.3%，而且anti－dsDNA高阳性率主要表现在系统性红斑狼疮性葡萄膜炎患者，符合文献报道的anti－dsDNA是系统性红斑狼疮的标志性抗体^[22,23]。因此，对于疑似系统性红斑狼疮性葡萄膜炎患者应积极进行anti－dsDNA检测，可提高诊断率。由于anti－dsDNA还可以反映系统性红斑狼疮的疾病活动度^[24]，在今后的工作中我们将进一步收集临床资料进而探讨anti－dsDNA表达与系统性红斑狼疮性葡萄膜炎发病及复发的相关性。

本研究中风湿病性葡萄膜炎主要表现为前葡萄膜炎和全葡萄膜炎，但不同类型风湿病性葡萄膜炎的主要发病部位不同，如脊柱关节炎性葡萄膜炎好发于前葡萄膜和全葡萄膜，原发性系统性血管炎性葡萄膜炎主要表现在全葡萄膜，说明不同类型的风湿病由于发病原因和发病机制不同，其产生的免疫反应不同，累及葡萄膜炎的具体解剖学部位是不同的，符合蔡军^[25]报道的由于视觉器官的各组织学类型不同，不同的免疫反应对视觉器官的影响部位不同，但具体发病机制还需进一步探讨。

综上所述，在北京及其周边地区，初诊非感染性葡萄膜炎患者中约有40%为风湿病性葡萄膜炎，脊柱关节炎和原发性系统性血管炎性葡萄膜炎是北京及其周边地区风湿病性葡萄膜炎的常见病因类型。HLA－B27抗原、ANA、anti－dsDNA和ANCA检测对部分风湿病性葡萄膜炎类型的辅助诊断有一定价值，临床医生应结合患者的临床表现，选择有针对性的实验室检查，这有助于部分风湿病性葡萄膜炎患者病因类型的辅助诊断。

参考文献：略